Lukas Langhoff assistierte ab 1992 bei Frank Castorf, Johann Kresnik und Christoph Schlingensief an der Volksbühne in Berlin und war von 1995 bis 1998 künstlerischer Leiter am Prater, der Nebenspielstätte der Volksbühne. Seit 1996 führt er Regie, u.a. am Schauspiel Leipzig, am Jungen Theater Göttingen, am Bremer Theater, am Schauspiel Hannover, Hans Otto Theater Potsdam und am Maxim Gorki Theater Berlin. Von 2001 bis 2008 führte er als Hausregisseur am Schauspiel Magdeburg Regie u.a. bei der Improsoap Voll auf Quote. 2006 entstand am Schauspiel Magdeburg das Rechercheprojekt Kinder zur Sonne; 2007 folgte das Projekt Klassentreffen ‒ Die 2. Generation am Hebbel am Ufer im Rahmen des Festivals Beyond Belonging sowie 2009/2010 am Ballhaus Naunynstraße Ferienlager ‒ Die 3. Generation. Pauschalreise ‒ Die 1. Generation von Hakan Savaş Mican in der Inszenierung von Lukas Langhoff wurde bei den Privattheatertagen 2012 in Hamburg mit dem Monica-Bleibtreu-Preis „für das beste zeitgenössische Drama“ ausgezeichnet. Mit seiner Inszenierung Ein Volksfeind am Theater Bonn wurde Langhoff zum Berliner Theatertreffen 2012 eingeladen.